五味子多糖均质酶解提取工艺优化（二） 糖均固定果胶酶加酶量1.33%

2、味多响应面优化

（1）BBD试验方案及结果

在单因素试验基础上，糖均固定果胶酶加酶量1.33%，质酶溶剂原料比25mL/g，解提选取提取温度（A）、取工均质转速（B）和提取时间（C）这三个显著因素为考察变量素，艺优每个因素取三个水平，味多进行BBD试验，糖均以多糖提取得率（Y%）为响应值，质酶对提取工艺条件进行响应面优化。解提实验设计及结果见表1。取工依据BBD实验结果，艺优用Design-Expert.8.0软件进行响应面分析，味多以多糖提取率为响应值分别对各因素进行多元线性回归拟合，糖均得到回归模型为：Y=10.53+0.53A+0.37B+0.11C-0.026AB-0.67AC-1.20BC-4.32A²-3.20B²-2.20C²；采用F检验进行方差分析，质酶结果见表2。由表2可知，回归模型显著水平P＜0.0001，表明回归模型显著准确，模型确定系数R²=0.9829，表明效应值的变化有98.29%以上是来自自选变量，本试验模型预测值与实际测量值具有高度的相关性，该模型的失拟度没有显著性差异，表明回归方程能较好地模拟真实曲面，检验方法可行。

本实验回归模型的调整确定系数R²_Adj=0.9609，说明该模型能解释96.09%试验数据的变异性。此数据表明，该模型拟合程度良好，试验误差相对较小。失拟项P=0.1121＞0.05，该实验变异系数C.V.%=10.87，据此证明可用该模型方程分析和预测不同提取条件下五味子多糖得率。由表2可知A因素对五味子多糖得率有极显著影响，B因素影响非常显著，其次是C因素影响，影响顺序为：A＞B＞C。

（2）响应面分析及工艺优化

利用Box-Behnken软件，根据建立的回归方程作出3D响应面图（图3）。从图3的3D图中分析可知，两因素对提取得率的交互作用由大到小依次为闪提速率和提取温度＞提取时间和提取温度＞闪提转速和提取时间。

固定提取时间2min，提取温度和均质转速对多糖提取得率的交互影响如图3（a）所示，在8500～15280r/min和35.00～48.52℃范围内均质转速增加和提取温度升高提取得率增加，之后随均质转速和温度的增加提取得率快速降低，说明在一定的范围内增加均质转速、升高提取温度，有利于组织细胞的破碎、多糖的溶解和扩散，提取得率增加；从3D图可以发现均质转速和提取温度对提取得率的影响程度接近；但是过高的提取温度和均质转速可能会造成多糖降解、结构被破坏，使得提取得率下降。

当均质转速一定时，提取温度和提取时间对多糖提取得率的交互影响如图3（b），在1.00～2.05min和35.00～47.66℃范围内随提取时间和提取温度的增加多糖提取得率增大，超过这一范围延长提取时间和升高提取温度多糖提取得率逐渐下降，提取温度对得率的影响程度明显高于提取时间的影响，主要原因可能是提取温度既影响多糖的溶解、扩散，又会影响到酶的活性，而在高速剪切作用下提取时间对多糖的溶解和扩散的影响是有限的。

当提取温度一定时，提取时间和均质转速对多糖提取得率的交互影响如图3（c）所示，由图可以发现较高的均质转速和较长的提取时间有利于多糖的提取，但闪提转速对多糖提取得率的影响程度明显高于提取时间的影响；说明在一定的转速范围内，增加均质转速组织细胞的破碎程度更加彻底，利于多糖的溶解、传质，提取得率快速增加；超过一定范围增加均质转速和时间可能会导致多糖结构被破坏致使多糖提取得率降低。

通过根据Box-Behnken软件对试验结果和响应面分析，获得均质酶解提取五味子多糖的最佳工艺条件为：提取时间1.92min、提取温度50.82℃、均质转速16319.73r/min。在此优化条件下进行提取实验，五味子多糖的预测提取得率为9.39%。选取果胶酶量1.33%、提取时间2min、提取温度51℃、均质转速16320r/min为实验条件，提取3次，计算多糖的平均提取得率为10.03%，与模型预测得率9.39%接近，说明建立的模型准确、可靠，可以用来预测五味子多糖的提取得率。

3、不同提取工艺提提取效率的比较

分别取3g预处理样品，用均质酶解和热回流提取五味子粗多糖，均质酶解提取得率为10.01%，热回流粗多糖提取得率为7.13%，均质酶解提取的提取得率提高40.39%；均质酶解提取时间2min，热回流提取时间是240min，时间降低了99.17%。为了比较2种提取工艺的提取效率，对热回流提取和均质酶解提取后的样品组织采用扫描电镜进行了观察，图4（a）为热回流提取后的五味子样品组织的微观结构，图4（b）为均质酶解提取后的样品的微观结构。从扫描电镜图可观察到热回流4h后的五味子样品放大600倍时，五味子细胞组织的微观结构相对比较完整，而将均质酶解提取后的样品放大400倍，观察到细胞组织的微观结构有较大程度的破碎，这是在分散机的强剪切和酶解的共同作用下细胞组织有较大程度的破碎，便于多糖的快速溶解、扩散，提取得率大幅提高、时间极短、能耗降低。因此均质酶解为植物活性多糖的提取提供了一种高效的绿色提取技术。
 

三、结论

通过单因素试验考察了各因素对多糖提取得率的影响次序和水平，固定果胶酶浓度为1.33%，采用响应面法优化得到了五味子多糖的最佳均质酶解提取工艺参数：提取时间1.92min，提取温50.82℃，均质转速16319.73r/min，该条件下多糖提取得率为10.01%，与模型预测值9.39%接近，说明建立的模型准确、可靠。本实验所采用的均质酶解法不仅时间短、提取率较高，而且操作方法简单，为植物活性多糖的提取提供一种高效的、绿色提取技术。

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